Desenvolvimento de um Vetor Plasmidial para a Integração Dirigida no Lócus rDNA de Leishmania Major

Foi demonstrado, previamente, através de ensaios de transfecção transitória, que a superexpressão do gene mini-exon de Leishmania major, envolvido no processo de "trans-splicing", diminui nitidamente o padrão de virulência de linhagens originalmente virulentas em camundongos BALB/c "in vivo". No entanto, quando camundongos BALB/c foram infectados com linhagens atenuadas superexpressoras de miniexon, notou,se que não havia desenvolvimento de lesão até cerca de 10 semanas após a infecção. Depois deste período, possivelmente devido à perda da molécula epissomal, a linhagem atenuada reverteu ao seu fenótipo virulento. O desenvolvimento de vetores, com características integrativas é necessário para o desenvolvimento de linhagens atenuadas superexpressando estavelmente o gene miniexon, que poderão tomar,se possíveis candidatos a vacinas vivas. O objetivo do presente estudo foi desenvolver um vetor ponte ("shuttle vector") que se integre, por recombinação homóloga, no locus do rDNA cujo promotor, reconhecido pela RNA polimerase I (Pol I), promove transcrição constitutiva em altos títulos. O vetor foi projetado para dirigir a integração do cassete de expressão para o espaçador ribossomal homólogo do rDNA de Leishmania amazonensis, região à montante do promotor do rDNA, e manter o transgene sob controle do promotor heterólogo do rDNA de L. amazonensis. Em ensaios de transfecção transitória, o rDNA de L. amazonensis mostrou,se mais ativo em hospedeiros heterólogos do que em homólogos, e induziu alta taxa de transcrição de genes sob seu controle. Além da região promotora, o vetor contém um sítio aceptor de "splicing" (para que o mRNA produzido possa ser processado adequadamente durante o processo de maturação), uma marca de seleção (necessária para selecionar os clones de interesse), e sequências flanqueadoras que apresentam cerca de 95% de homologia com os elementos repetitivos do espaçador intergênico ribossomal (para que ocorra a integração sítio-dirigida no locus rDNA por recombinação homóloga).